量子点的标记方法及量子点标记的不足

量子点可以与特定抗体或小分子结合，在不改变其化学特性的情况下，受到光源激发后可发出特定波长的荧光，实现对靶标的识别及检测。量子点与生物大分子如核酸、蛋白质、养分载体等之间的结合，通常有以下几种方法：静电吸引法、常规交联剂连接法及生物素-亲和素法等。

量子点的标记方法

（一）静电吸引法

正电荷氢核遇到另一个电负性强的原子时，产生静电吸引。巯基乙酸修饰的量子点表面带负电，与带正电的蛋白质表面区域可通过静电吸引连接起来，而不需要其他试剂。对于带中性电荷的蛋白质，可以通过改造蛋白质在其末端构建带正电荷的结构，使其能静电吸附于量子点表面。另外，通过对量子点表面修饰使其带负电荷后，除了上述的直接静电吸引靶标物质外，还可以静电吸附连接上亲和素，然后依靠生物素-亲和素的高特异性结合，间接将量子点连接到蛋白质分子上。这种连接降低了量子点的表面缺陷，增加了量子点的荧光强度。不过当蛋白质的比例过大时，蛋白质之间产生交叉结合使部分量子点聚积，从而降低了量子点荧光强度。因此，控制量子点与靶标蛋白的比例对检测灵敏度至关重要。

（二）常规交联剂连接法

交联剂是一类小分子化合物，相对分子质量一般在200～600u，具有两个或者更多的针对特殊基团（如氨基、巯基等）的反应性末端，可以和两个或者更多的分子偶联从而使这些分子结合在一起。常用的交联剂有1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺（EDC）、N，N′-二环己基碳二亚胺（DCC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、戊二醛、二异氰酸化合物和二卤化二硝基苯。利用这些交联剂可以使量子点上修饰的羧基与小分子物质的氨基通过缩合作用进行偶联标记。已有人利用EDC及NHS交联方法，将1，3-二氨基-2-丙醇偶联到羧酸化量子点上，使其羟基化，减小了量子点尺寸（13～14nm直径）、增加了其荧光强度及在酸性或碱性环境下的稳定性，大大降低了量子点与细胞膜或蛋白质的非特异性结合（只有羧基化量子点的1/140）。经配体交换修饰的QDs用EDC和NHS法可以连接到成纤维细胞上，这种量子点可以穿透细胞膜，到达细胞核。

（三）生物素-亲和素法

生物素-亲和素系统（biotin-avidinsystem，BAS）是20世纪70年代后期迅速发展起来的一种新型生物反应放大系统，在生命科学研究领域有着广泛的应用。由于它具有生物素与亲和素之间的高度亲和力及多级放大效应，并与荧光素、酶、同位素等免疫标记技术有机地结合起来，使各种示踪免疫分析的特异性和灵敏度进一步提高。目前，将量子点与生物分子结合的最常用方法就是通过生物素-链（霉）亲和素系统结合，用于抗原抗体相互识别、活体标记及特异性标记，这种量子点探针灵敏度高、荧光信号强。

（四）其他标记方法

Feng等（2007）利用异源双功能交联剂琥珀酰亚胺-4-（N-马来酰亚胺甲基）-环己烷-1-羧酸盐把量子点与抗体或配体的巯基通过缩合反应偶联到一起，用于毛细血管电泳法测定人IgM，效果良好。

量子点标记后，通常要分析鉴定标记物的质量，通常采用的方法有光谱分析和琼脂糖电泳法。光谱分析是通过吸收光谱及发射光谱的蓝移、红移来确定偶联是否成功。而琼脂糖电泳时由于偶联物大小与量子点大小不同而导致其电泳速度明显不同，通过对电泳条带分析，可以判定偶联是否成功。

量子点标记的不足

量子点标记能诱导氧自由基的产生，因此对生物活性物质具有一定毒性，不过这些毒性可以通过偶联到蛋白质分子上或者是覆盖一层低毒物质来降低。量子点和某些蛋白质结合后可能导致量子点的荧光减弱或淬灭，如铜/锌-超氧化物歧化酶对CdSe量子点的荧光有明显的淬灭作用。如果量子点标记用于试纸的制备，其使用过程中需要紫外光源用于色泽变化的观察，与肉眼观察即可判断检测结果的其他类型试纸相比，操作程序稍显复杂。